透射荧光显微镜与反射荧光显微镜的区别及优缺点

1、透射荧光显微镜：激发光源通过聚光镜穿过试样材料激发荧光。常用暗场聚光器，也可使用普通聚光器，调节反射镜使激发光向试样转移和侧射。这是一种相对老式的荧光显微镜。优点是在低倍率下荧光强，但缺点是随着倍率的增加荧光减弱。因此，最好观察较大的试样材料。
2、落射荧光显微镜：这是现代发展起来的一种新型荧光显微镜。不同之处在于激发光从物镜下落到试样表面，即照明聚光器和收集荧光的物镜使用同一个物镜。需要在与光学铀成 45 度角的光路中添加二色分束器。激发光被反射到物镜中并集中在样品上。样品产生的荧光被物镜表面和盖玻片表面反射。同时，激发光进入物镜，返回二向色分光镜，使激发光和荧光分离，剩余激发光被阻挡滤光片吸收。例如，可以使用不同的激发滤光片/双色分光镜/阻挡滤光片的组合来满足不同荧光反应产物的需要。这种荧光显微镜的优点是视野均匀，成像清晰，放大倍数越大，荧光越强。
透射荧光显微镜的优缺点
光源：高压汞灯或卤素灯。
聚光镜：使用暗场聚光镜来分离激发光和荧光。
目标：可以使用任何类型的目标。
标本：因为是透射观察，薄标本比较适合。
优点：①由于使用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗背景并获得良好的对比度，任何物镜都可以进行观察。 ② 使用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。
缺点：聚光镜的中心和高度必须调整正确，否则无法获得明亮的荧光图像。由于暗场聚光镜的焦距限制，不能使用厚载玻片。视场的照明面积不宜过大，否则荧光标本的荧光颜色很容易褪色。不适用于厚的或不透明的样品。
反射荧光显微镜的优缺点
光源：高压汞灯或卤素灯。
聚光镜：由于物镜充当聚光镜，因此不需要聚光镜。
事物镜子：使用的物镜必须透过足够的紫外光，本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。
标本：可以观察到厚标本或不透明标本。
优点：①由于物镜兼作聚光镜，无需进行多次调整。 ②孔径光阑和视场光阑的效果可以通过使用Korra照明法来发挥。 ③物镜的数值孔径不受限制，在高倍率下也可以获得高分辨率的图像。 ④也可以观察厚或不透明的标本，也可以使用厚盖玻片。 ⑤其他观察方法也可与反射荧光结合使用，特别是与相差法和透射微分干涉差法结合使用。 ⑥可避免不必要的荧光褪色现象。
缺点：使用地倍率物镜时，成像比较暗，必须使用数值孔径大的物镜。滤光片系统必须有效地分离激发光和荧光。